摘 要：自然界的生物大分子如硅藻蛋白质silaffins上的多聚碱性氨基酸、禾本科植物细胞多糖可直接作用于生物硅化过程，使生物细胞从自然环境中选择性地吸收可溶性硅，聚合形成各种精美的无定型生物硅微观结构。本实验根据仿生学原理，在室温、近中性pH和以硅酸钠为原料等条件下，比较研究了聚酰胺（PAM）、聚酰胺胺（PAMAM）、聚乙烯醇（PVA）等含胺基和羟基的水溶性高分子在体外介导硅酸聚合形成纳米SiO2的过程，结果表明在体外硅酸聚合的过程中静电相互作用是主要驱动力，有“人造蛋白”之称的树状化合物PAMAM介导效果远优于PAM和PVA。PAMAM G2.0在PAMAM:Si（摩尔比）低达1：1000时，仍能介导纳米SiO2的形成；形成的纳米PAMAM-SiO2复合物粒径约为50nm，粒度分布均匀，具有纳米材料特有的光学性质。
关键词：PAMAM，生物硅化，纳米二氧化硅，仿生，介导
1．引言
目前，纳米或者超细SiO2粒子的研究是纳米材料研究领域的一个热点。广泛使用的物理化学方法合成纳米SiO2需要强碱性环境、高压和特殊的设备等，资源能耗大，试剂污染严重。而放眼自然界，硅藻细胞壁、海绵针状体以及一些高等喜硅植物体内都存在着精致的纳米硅结构，这些有趣的生物硅化现象吸引了越来越多的人着眼于仿生硅化的研究。
以硅藻或海绵为代表的生物硅是由细胞壁中大量存在的富含赖氨酸和精氨酸残基的多聚阳离子肽silaffins在硅沉积泡的酸性环境下（pH~5）介导硅酸聚合形成的，其介导机制是通过静电相互作用和氢键使单硅酸分子以介导物为核心相互靠近，然后硅酸分子间发生亲核取代而形成硅氧键，多个硅酸分子聚合形成一定粒度的硅球[1]，这种生物矿化速度比一般的无机反应要高106倍[2]。以喜硅植物特别是禾本科植物为代表的生物硅的沉积，则主要发生在细胞壁、细胞间隙或导管内，依靠双亲性多糖或者糖蛋白模板与硅酸的硅羟基形成－SiO(OH)单元，形成二聚体和聚硅酸，最后沉积成纳米SiO2球。在此过程中，K＋等在作用部位的富集很可能对反应起推动作用[3－5]。Perry等人[6]的研究表明以纤维素为代表的多糖对纳米硅颗粒的生长和空间组装起决定作用。房江育等[7]则通过实验证实了过氧化物酶形成的酚类聚合物可以类似silaffins在体外诱导纳米硅球的形成。
对各种生物硅化天然多聚阳离子肽分子仿生研究发现，不仅天然的silaffins和相关生物体内的硅沉积蛋白，其他结构、性质类似的有机高分子如具有氨基或胍基的多聚赖氨酸、多聚精氨酸等以及经过修饰改性的链状多胺，也能够在常温、近中性环境下介导或协同介导纳米硅球的形成[8－13]。仿生硅化方面的研究取得了很多重要成果，但离真正意义上的产业化要求相距甚远。许多研究采用的硅源是化学合成的硅复合物或硅醇盐、正硅酸酯等，这是有悖于自然界简单的硅酸盐环境的。
我们选取了聚丙烯酰胺（polyacrylamide， PAM）、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol， PVA)和树枝状化合物聚酰胺胺（polyamidoamine，PAMAM）三种双亲性高分子进行仿生硅化实验研究。
聚乙烯醇和聚丙烯酰胺是常见的絮凝剂，分别带有多个侧链羟基和氨基。其中，PAM也是具有胺基的长链高分子，曾被证明在碱性条件下对硅的沉积有一定作用[14]。
聚酰胺胺（图1，B）是近年来合成与研究的树状聚合物的典型代表，是一类可以精确控制分子大小、形状和官能团位置的单分散性合成化合物，直径由1.5nm（G0）到13.5nm (G10)线性增加。具有一定的生物亲和性，被形象地称为“人造蛋白质”[15]。整代低代数(3.0G以下)的PAMAM具有带正电荷的末端伯胺基和可以形成氢键的骨架内仲胺基，分子结构相对疏松，由中心向外对称发散的分支结构通过仲胺基和末端伯胺基形成合成纳米复合材料的理想模板。利用PAMAM的模板、骨架或者催化剂作用，少量的无机客体原子或分子分散在PAMAM内部或表面形成无机功能区，已报道合成了Cu-PAMAM、Ag-PAMAM、Au-PAMAM、Pt-PAMAM[16－19]等树状金属纳米复合材料，在生物医学、成像技术中充当催化核心、光学标签等很有应用前景。
图1 作为纳米硅的生物合成的介导物的化学结构比较。(其中A为从硅藻C.fusiformis中提取出来的silaffin的结构，B为G1的PAMAM，C为多聚赖氨酸，D为多聚精氨酸.)
本文采用PVA、PAM和整代低代数（G2.0）PAMAM三种双亲性高分子作为硅沉积的模板，以硅酸钠为硅源，在室温，中性环境下介导二氧化硅的合成，旨在比较静电相互作用和氢键二者对硅酸缩聚的影响，以及高分子的不同形态对聚合速度及形态的影响。通过实验我们用2.0G PAMAM介导制备了粒度可控的纳米二氧化硅材料。
2材料和方法
2.1 材料
实验所用聚酰胺胺（polyamidoamine，PAMAM， 0G，1.0G，2.0G， 其分子量分别为516，1428和3252）由发散法制备[20]，由中南大学资源加工与生物工程学院生物技术实验室提供。聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol， PVA，MW=124万，分析纯）；聚丙烯酰胺（Polyacrylamide，PAM，MW=300万，分析纯）；其它试剂均为分析纯。双蒸馏水。
2.2 硅含量分析和SiO2沉淀过程监测
硅含量分析采用硅钼黄显色法[11]。按照介导物与硅酸钠的一定摩尔比，在搅拌下，向10mmol/L硅酸钠溶液（pH7.2的Tris-HCl缓冲溶液）滴入介导物。然后，在一定的时间间隔，取出2.00ml 反应液，加入到25ml去离子水中，加入1ml 1.5mol/L H2SO4，1ml 0.08 mol/L钼酸铵，混匀后静置10min。在这段时间里，可溶性的单硅酸和小分子硅酸低聚物与钼酸铵反应，生成黄色的硅钼酸（H8Si(Mo2O7)6），而已经发生聚集形成的二氧化硅不会与钼酸铵发应。用双光束紫外可见分光光度仪（UV-3000，日本岛津）在400nm处测定溶液的吸光度值。通过分析溶液中可溶性硅酸和小分子硅酸低聚物随时间的变化可以监控硅酸聚合趋势。
2.3 纳米SiO2表征
用Zata电位及粒度分析仪（DELSA 440SX ， coulter USA）检测纳米SiO2在溶液中的粒度分布。采用双光束紫外可见分光光度仪（UV－3000，日本岛津）测定纳米SiO2的特征紫外吸收。反应产物经热处理除去复合物中的有机物成分，得到白色超细粉末后，采用Sirion200场发射扫描电子显微镜（FEI公司）检测产物表面以及粒度分布情况。
3. 结果与讨论
3.1 介导作用
实验所用的0.001mol/L的硅酸钠溶液在室温下为透明无色溶液，放置2天观察不到明显变化。但以PAMAM与硅的摩尔比为1：10在搅拌条件下滴入PAMAM（G3）树状大分子时，立刻产生白色沉淀。当以PAMAM与硅摩尔比1：100加入时，几秒内也可以见明显沉淀。测定反应溶液中剩下游离硅酸，发现含量锐减。当PAM、PAV和PAMAM分别以单体:Si=1:10，1:10和0.28:10的摩尔比加入到反应体系，3小时内溶液澄清透明，肉眼观察不到明显沉降现象，继续延长反应时间PAMAM/Si的反应体系最先出现轻微的浑浊。
图2反映的是介导反应的前3小时内用三种多聚物介导硅酸聚合的过程。曲线表示钼黄法连续测得的反应液的紫外吸收变化情况，它表明了反应过程中溶液中可溶性硅酸和低聚硅酸的含量变化情况。从图上可以看出，这三种高分子对硅的聚合都有介导作用，但作用效果以PAMAM（G2）最好，因为它的单体浓度相对PAM和PVA 的单体浓度低3.6倍时，其介导反应速度仍然大于前两者。PAV、PAM可以分别以侧链羟基、侧链酰伯胺基通过氢键的方式与硅氧键合，而PAMAM则能以端胺基离子和酰仲胺分别以静电和氢键的方式与硅氧结合。从单体介导作用顺序（PAMAM>>PAM>PAV）来看，说明在多聚物于硅的共沉淀过程中，静电相互作用的介导效果比氢键的更大。
图 2 PAMAM与其它高分子化合物对硅聚合的介导作用比较 (pH 7.2， 高分子化合物PAM、PAV和PAMAM的单体与硅的摩尔比分别为1:10，1:10，0.28:10)
比较图1的各种高分子的结构，不难发现它们共同的特点是都具有带正电荷的胺末端或侧链。-NH3+正电荷对硅球成型具有促进作用。早期的Stöber工艺[21]在具有一定胺浓度的醇溶液中，采用烷基硅酸盐的水解提供硅酸源，短时间内聚合生成一定大小（0.05～2μ）的硅球。其中，胺是作为成型的促进剂，其浓度越大，得到的颗粒尺寸越大。Mizutani T et al. [14]也证明了合成多胺和多聚-L-赖氨酸在pH 8.5可以促进硅酸的缩聚。前面所述的硅藻的生物硅化一般都跟胺基化合物密切相关。
当然，在常温，中性环境下以这些含胺多聚物为模板和促进剂，通过温和的反应合成纳米硅球，除了端胺基的静电相互作用外，多聚物内部的仲胺基的氢键作用也许不容忽视。但离子化的端胺基静电相互作用较强，空间位阻较小，能吸引更多的硅酸聚集到端胺基位点附近，使得局部硅酸浓度增大而有利于聚沉。溶液中，来自不同硅源的硅最终以单体或寡聚硅酸或硅酸阴离子的形式存在。在此条件下，由于胺基的存在，模板一般带正电荷。静电相互作用使得这些游离的硅酸小分子向模板的特定位置聚集，多聚物的胺基位点就成为了硅沉积的成核位点。此时，硅羟基之间失水缩合，逐渐有单硅酸聚合成二聚体，三聚体，多聚体，最终按一定方式组装成一定尺度的硅球。
3.2 成型模式
通过介导形成的纳米硅球在经过适当的处理前基本上都是有机高分子与二氧化硅的有机-无机复合物。网状，树状或链状的复杂高分子成为这些复合物的骨架，随着硅逐渐沉积到模板上面，复合硅球的尺度逐渐增大[22]。
链状高分子和星形树枝状化合物介导合成的区别还体现在组装方式上。聚酰胺胺星形树枝状聚合物具有两亲性，但这种特殊的球状分子又不同于一般的线型表面活性剂，而且它的结构更加规整。PAMAM本身直径属于纳米级范围，从一个乙二胺的核心向外空间发散，每次经Michael加成反应与酰胺化反应形成一个分枝，每完成一个完整的接枝循环就形成一代，结构和直径大小以有趣的物理线性增加。整代的PAMAM分支末端为带正电荷的胺基，末端的伯胺和它内部分支处结构有序的仲胺和叔胺都可能成为二氧化硅聚沉的成核位点。低代数的PAMAM（如<3.0G）由于结构疏松，有利于无机分子进入PAMAM内部，而充分发挥内部分支成核位点的作用。
虽然长链多聚物也可以将颗粒交联在一起参与二氧化硅共沉淀。但链状高分子的电荷是沿主链分散的，且侧链伸展方向有一定的随机性，必然影响硅酸的聚集和凝沉。即使它自由地折叠成一定的形状，受空间位阻和其它因素的影响，这些相对无序的链状阳离子多聚物介导硅酸沉降的效果远远比不上结构整齐的PAMAM。最近，Marc等人报道了用氨基末端的树状化合物PPI（polypropyleninimine）和PAMAM作为模板的纳米生物硅仿生合成方法。他们用PAMAM介导得到直径95nm到400nm大小的纳米硅球，实验过程中硅与PAMAM的摩尔比可达到40：1（G2）到500：1（G6）的范围，相比之下silaffin-1A只能达到12：1[2][23]。
我们采用不同代数的PAMAM（0G， 1.0G， 2.0G）以物质的量之比PAMAM/Si为1：1000介导硅的聚合发现，在反应之初的一个小时内，PAMAM代数越高的介导溶液中，反应速度越快，由于代数越大的PAMAM胺基位点越多，这也证明了静电相互作用是最主要的作用方式。但是随着反应时间的延长，溶液中所剩余的硅酸含量基本相当，不同代数PAMAM对硅聚合的影响很可能主要体现在形态控制上的区别。
3.3 PAMAM介导产物的表征
星形树枝状PAMAM化合物是人工合成的、可以设计其分子大小和内部高度有序结构的有机化合物。用PAMAM为模板介导合成生物硅，可以通过控制模板的方式来较好地控制产物的粒度和结构。图3是PAMAM G2.0介导产物经自然干燥后的扫描电镜显微图。从图3可知介导产物的形状规整，粒度均匀，粒径约50nm左右，说明聚酰胺胺模板能够理想地控制产物的形状和粒度。由于PAMAM G2.0单个分子的理论大小约2.9nm，因此可以推想经过PAMAM G2.0介导得到的纳米硅球应该包含着一定数量的纳米PAMAM，即为PAMAM-SiO2复合物。采取高温灰化处理，将介导物PAMAM除去，可得到单颗粒的介孔纳米材料（结果未给出）。
图3 合成的产物的SEM图片（标尺：500nm）
纳米粒子在溶液中的分散行为决定了它的应用范围和应用形式。将PAMAM介导实验的聚沉物分散在水溶液中，用Zata电位粒度仪测定所得产物的粒度大小，发现有多种粒度分布范围，且随着时间的变化，小粒径的粒子量逐渐减小，而更大尺度的粒子不断出现，含量也不断提高；采用超声处理，可以使小粒径的粒子增加，平均粒径减小（见表1）。说明产物粒子在水溶液中存在物理团聚现象，有必要进一步研究合适的分散体系。虽然用Zata电位仪测得的是粒子的团聚体而无法正确反映纳米粒子本身的大小，但从表1所列数据仍然可以得出结论：代数越高、胺基浓度越大的PAMAM介导合成的硅球的直径也越大。表1 各代的PAMAM的物理参数及其介导合成的硅球粒度分布
 紫外吸收是纳米粒子典型的光学特性。当粒子达到一定尺度后，在同样的光强下随着粒径的增加吸收光谱将发生红移。图4是不同代数PAMAM介导下反应产物水溶液的紫外吸收光谱，结果表明代数越高的介导物，所得产物的紫外吸收峰红移，吸光强度也随之增大。预示着在一定的分散介质中，PAMAM G2.0介导的纳米硅球将具有更好的应用前景。
图 4 PAMAM介导形成的纳米SiO2水溶液的紫外吸收光谱
3.4 产物的应用前景
实验制得的PAMAM-Si纳米复合物如果能成功解决单分散问题，在生物工程诸领域有很广的应用潜力。壳核型纳米二氧化硅经过表面氨基化可作为非病毒型基因载体，并且能够保护所转运的基因免受核酸内切酶的降解[24～25]。最近报道了内部包埋绿色荧光蛋白，外部结合PAMAM的介孔硅纳米微球作为基因转染载体在生物技术中有广阔的发展空间[26]。
我们实验制得的PAMAM-Si复合纳米球，是由PAMAM为骨架，硅酸逐渐沉积到它的特定位点组装形成的有序结构，含有大量双亲性生物亲和性基团，且制备方法简单，产物粒度可控，也可考虑作为基因载体使用。通过热处理除去复合物中的有机组分，得到的介孔硅球表面和内部的空腔都分布着极易与其它基团（如氨基）发生反应的硅羟基，可直接或通过改性后包埋或结合荧光染料（GFP等）、药物分子等， 并且选择性地与细胞膜上的特定蛋白质结合，作为分子信标或药物控释系统。在材料、食品、药品、化工等其它领域，纳米硅的应用更加广泛。
4 结论
生物硅的合成是一项奇妙的生物化学技术，与简单的物理化学方法，如磁控溅射法，溶胶-凝胶法等相比，成本低廉，环境友好，是人类认识和改造自然的又一次进步。
本实验基于仿生学原理，在室温、中性环境下探讨了三种有机模板对硅酸聚沉速度和方式的影响，发现目前研究较多的两种生物硅的成型的主要作用中，静电相互作用是硅酸盐聚合最大的驱动力。静电相互作用和氢键共同作用，造成了一定形态和大小的硅球在有机模板上聚沉。胺基相对浓度的大小，模板结构的有序程度直接影响无定型的纳米硅的聚沉方式。
pH 7.2的中性环境下，胺基末端的树状聚合物PAMAM是一种效果很好的催化剂，迅速介导纳米二氧化硅的聚集和沉淀，实验得到了尺度约为50nm的纳米PAMAM-二氧化硅复合物颗粒。由于树状化合物的高度有序的分型结构和固定的胺基位点，反应产物形态规则、粒度可控，可以根据需要采用不同代数的PAMAM，得到不同尺度范围的产物。产品在基因工程，药物载体，分子信标及其它领域可望有较好的开发和应用前景。
参考文献
[1] Coradin T, Lopez P. Biogenic silica patterning: simple chemistry or subtle biology?[J]. J ChemBioChem, 2003, 3:1-9.
[2] Kröger N, Deutzmann R, Sumper M. Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation[J]. Science, 1999, 286:1129-1132.
[3] 王荔军，李敏，李铁津. 植物体内的纳米结构SiO2[J]. 科学通报，2001,46(8):625-632.
[4] 王荔军，王运华，范明生. 有序的介观尺寸生物SiO2针的形成[J]. 化学学报，2001，59（12）:2213-2216.
[5] 王荔军，吴学民，郭中满. 细胞壁模板诱导介观尺寸生物SiO2材料合成[J]. 化学学报，2001，59（5）:784-787.
[6] Perry C C, Lu Y. Preparation of silicas from silicon complexes: Role of cellulose in polymerization and aggregation control[J]. J Chem Soc Faraday Trans, 1992, 88(19):2915-2921.
[7] 房江育，王贺，陈阳. 过氧化物酶催化酚类聚合反应诱导纳米硅球的形成[J]. 自然科学通报，2003，13（6）:647-650.
[8] Kröger N, Deutzmann R, Bergsdorf C, et al. Species-specific polyamines from diatoms control silica morphology[J]. PNAS,2000, 97(26):14133–14138.
[9] Perry C C, Keeling-Tucker T. Biosilicificarion: the role of the organic matrix in structure control[J]. J Biol Inorg Chem, 2000, 5:537-550.
[10] Coradin T, Roux C, Livage J. Biomimetic self-activated formation of multi-scale porous silica in the presence of arginine-based surfactants[J]. J Mater Chem, 2002, 12:1242–1244.
[11] Coradin T, Livage J. Effect of some amino acids and peptides on silicic acid Polymerization[J]. Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 2001, 21:329-336.
[12] Brott L L, Naik R R, Pikas D J, et al. Ultrafast holographic nanopatterning of biocatalytically formed silica[J]. Nature, 2001, 413:291-293.
[13] Patwardhan S V, Clarson S J. Silicification and biosilicification: Part 5 An investigation of the silica structures formed at weakly acidic pH and neutral pH as facilitated by cationically charged macromolecules[J]. Mater Sci Eng, 2003, 23:495–499.
[14] Mizutani T, Nagase H, Fujiwara N. et al. Silicic acid polymerization catalyzed by amines and polyamines[J]. Bull Chem Soc Jpn, 1998, 71:2017-2022.
[15] Bielinska A, Eichman J D, Balogh L, et al. Imaging { Au0-PAMAM } gold-dendrimer nanocomposites in cells[J]. J Nanoparticle Res, 2002, 4:395–403.
[16] Torigoe K, Suzuki A, Esumi K. Au (III)–PAMAM interaction and formation of Au–PAMAM nanocomposites in ethyl acetate[J]. J Colloid Interface Sci, 2001, 241:346-356.
[17] Balogh L, Valluzzi R, Laverdure K S, et al. Formation of silver and gold dendrimer nanocomposites[J]. J Nanoparticle Res, 1999, 1:353–368.
[18] Zhao M, Sun L, Crooks R M. Preparation of Cu nanoclusters within dendrimer templates[J]. J Am Chem Soc, 1998, 120(19):4877-4878.
[19] Esumi K, Isono R, Yoshimura T. Preparation of PAMAM- and PPI-Metal (silver, platinum, and palladium) nanocomposites and their catalytic activities for reduction of 4-nitrophenol[J]. Langmuir, 2004, 20:237-243.
[20] Tomalia D A, Baker H, Dewald J, et al. A new class of polymers: Starburst-dendritic macromolecules[J]. J Polym (Tokyo), 1985, 17:117-132.
[21] Stöber W, Fink A, Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range[J]. J Colloid Interface Sci, 1968, 26:62-69.
[22] Sun Q Y, Vrieling E G, van Santen R A, et al. Bioinspired synthesis of mesoporous silicas. Current Opinion in Solid State and Materials[J]. Science, 2004,8:111-120.
[23] Knecht M R, Wright D W. Amine-Terminated Dendrimers as Biomimetic Templates for Silica Nanosphere Formation[J]. Langmuir, 2004, 20:4728-4732
[24] 何晓晓，王柯敏，谭蔚泓. 基于氨基化SiO2纳米颗粒的新型基因载体[J]. 科学通报，2002，47（18）：1365-1370.
[25] 朱诗国，吕红斌，向娟娟.一种新型的非病毒DNA传递载体：多聚赖氨酸-硅纳米颗粒[J]. 科学通报，2002，47（3）：193-197
[26] Radu DR, Lai C Y, Jeftinija K, et al. A polyamidoamine dendrimers-capped mesoporous silica nanosphere-based gene transfection reagent[J]. J Am Chem Soc, 2004, 126:13216-13217.(end)
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