用于病毒和蛋白纯化的膜吸附器 - 文章

用于病毒和蛋白纯化的膜吸附器

作者：德国赛多利斯公司 Stefan Fischer-Fruehholz

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寻找一种新的活性药物成分需要一个漫长的过程, 它的制备和提纯也同样需要时间。目前在制药工业中，对药物组分的纯度级别要求越来越高，并且将新药推向市场的时间也要求越快越好。膜吸附器可以快速纯化蛋白，同时，它还具备其他的优势。

据近期的报道，没有任何一个其他的行业能像生物制药行业一样，年增长率达到近15%。药品开发的数量也逐年增长，细胞培养制备单抗的浓度达到了5～10g/l, 这被称之为这一行业的技术革命。然而，这种繁荣的局面通常会导致生产能力不足的问题，因此，为生物制药行业而设计的新的生产设备应运而生，同时在其下游工艺中也需要革命性的纯化方式。

生物反应器培养之后的下游工艺。这一步骤中，活性药物成分必须从细胞中分离出来。膜吸附器在这里已经占有一席之地。它在蛋白和腺病毒的纯化中，是去除DNA污染的常规工具。除此之外，膜吸附器还有更多的应用，如果有合适的配体,它是去除蛋白酶、酶和毒素的理想工具。

与传统的介质相比，膜吸附器的动态结合能力非常强，用最小的柱床体积就能达到快速的纯化。因此，除了病毒的纯化之外，对蛋白的捕获这一应用将会占有更重要的地位。

更大的表面积

膜吸附器也能应用在高分辨的层析中，可以用分步洗脱法对大量料液进行快速层析。只要选用设计为表面积大、膜孔径大(0.45和3μm)的膜吸附器时, 都可以考虑这种应用。

膜吸附器的设计，如圆柱状的生产规模的Sartobind MultiSep，柱床体积为2.1L（8m2膜面积），其有效表面积达到1300cm2。流道尺寸的设计兼顾到了最小的残留体积和高流速，在压力为0.6MPa时，流速约50L。由于膜是折叠并卷起来的，不像凝胶柱一样紧密地压在一起，因此膜吸附器的接触面积和残留体积也相对较大。

Sartobind MultiSep

操作简单

使用色谱柱时需要小心操作，保证没有气泡，否则会使色谱柱受损。流速低时要监测系统压力。当然，膜吸附器的操作过程也需要避免产生气泡。但是，既使产生了气泡也不会损坏柱床结构。你可以很容易地将气泡赶出，如果采用小型的针头式膜吸附器，将进样管朝上提起即可，大型的膜吸附式囊式滤器和滤芯都有通气阀，专用于排出气泡。由于色谱柱是共价结合，所以不会破裂或腐蚀。

使用脉动泵不会损伤膜吸附器，蠕动泵非常适用，因为它几乎没有背压。膜吸附器是即取即用型的，并且可以逐级洗脱。

膜吸附的形式会让使用者想到，也许完全不需要预过滤。其实，膜吸附器在这一点上与色谱柱没有什么不同，都需要用0.45μm或0.2μm的膜进行预过滤。

膜吸附器与色谱柱相比，更像一种过滤器，尤其适合希望简化操作的用户。由于这种需求的增加，甚至还设计出了一次性使用的膜吸附器如Sartobind SingleSep囊式滤器。这种类型的产品在制药行业蛋白的生产中广泛应用，主要通过离子交换原理来去除污染。一次性的产品省去了原本必须的一些验证步骤，从而降低了成本。

适合的柱床尺寸

传统层析中扩散的速度有限，由于其流速慢，所以一般选择柱子时不是按照它的结合能力，而是根据流速。通常会选则很大的柱床体积以保证在较短时间内完成层析。这必然增加了吸附的表面积，使产品和柱材质之间的非特异性交叉反应增加，从而损失一部分样品。

同时，生产过程中的验证成本也增加。例如，从经济角度考虑，较大的色谱柱不可能只用一次就丢掉。而膜吸附器可以实现经济型一次性的层析。尤其在制药行业蛋白的生产中，选择适合尺寸的柱床，有效地减少了产品损失，从而增加了产量。

离子交换膜（Sartorius公司的Sartobind Q）在2001年首次被FDA批准使用在10000L处理量的制药生产中，用于定量去除DNA和减少病毒。在这一应用中，抗体溶液先滤过一个protein A膜柱，再用Sartobind Q MultiSep15-06 (6cm高，15层膜的圆柱状膜吸附器) 或Sartobind Q MultiSep15-50 (50cm高，15层膜的圆柱状膜吸附器) 处理后，DNA杂质的含量减少至检测线以下。下面是定量去除DNA的两个实例。第一个案例中，8个批次的2000L发酵液，平均DNA的去除率为168pg DNA/mg蛋白；第二个案例中3个批次的12000L发酵液，平均DNA的去除率为187pg DNA/mg蛋白。

用孔径大于3μm的膜，可以成功地去除病毒污染。膜吸附器对生物大分子和病毒的结合能力，比传统胶要高得多。用膜吸附器纯化腺病毒的方法已较成熟，细小病毒如densonucleosis病毒，适合用阴阳离子交换膜进行纯化。

快速层析

用膜吸附器替代柱子，典型的例子是用protein A膜从细胞培养液中快速筛选免疫球蛋白, 如果用Sartobind Protein A 75针头式的吸附器，纯化过程只需要大约10min，而用柱层析则需要1h。如果用离心式的膜吸附器，一次可以纯化多个免疫球蛋白样品。Protein A膜吸附器在反复使用5～10次之内，与传统的层析柱相比，能保持较高的流速。重复使用时，色谱柱不仅背压会增加，而且柱容量会降低。而膜吸附器的容量，在流速增加时，仍能保持不变。

总结：膜吸附器这种产品为层析法开辟了一片新天地，它不需要把待纯化的蛋白一次性地加入一根大的层析柱中，而是可以利用很小的柱床体积的吸附器，在短时间内通过循环步骤完成。用膜吸附器替换某些层析产品，尤其是需要昂贵的配体的亲合层析，是不错的选择。(end)

文章内容仅供参考 (投稿) (5/23/2005)


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