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脉冲式微透析法葡萄糖传感器系统 |
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1 引 言
自60年代Clark发明葡萄糖氧化酶(GOD)——过氧化氢产物的酶电极、80年代证实皮下组织(S.C.)液的葡萄糖(G.S.)浓度与血的一致以来〔1〕，利用酶电极并从S.C.采样以动态监测血糖的研究正在走向实用阶段。本文将所构建的新的脉冲式微透析法葡萄糖传感器系统及其体外特性、抗干扰能力和温度特性的研究报道于下。
2 检测原理和实验方法
2.1 检测原理
脉冲式微透析法葡萄糖传感器系统的检测原理参见图1。 
图1 脉冲式微透析葡萄糖传感器系统的检测原理
图中的脉冲式微泵内装有CPU，可按需定时定量泵出液体。本研究中每20分钟泵磷酸缓冲液(pH7.4)20μl至微透析探针的导管内。导管外层为微透析膜。导管内外液体中的各物质依据各自的浓度梯度在20分钟内从高浓度向低浓度扩散。在体内，探针置于S.C.,故S.C.中的G.S.将向缓冲液中扩散。在本研究中，探针置于不同浓度的G.S.中。其后，含G.S.的缓冲液经管道系统泵入流动室。流动室以白金为阳极，电压+700mv,Ag/Agcl为阴极。室外是改良的YSI酶膜，其上固定着GOD和过氧化氢酶。在酶膜和电极之间是一层Teflon膜，以滤过大分子干扰物。G.S.在流动室的反应如下〔2〕： 
与流动室相连的电流计将此反应电流放大、输出。电流的大小与G.S.浓度成正比，其值由曲线记录仪记图如图2。
2 脉冲式微透析法葡萄糖传感器输出信号
脉冲式微泵、流动室、微透析探针、残液回收器由德国Eppendorf公司协同研制、提供；Biometra Ep 30电流计、BD101双笔式曲线记录仪、循环加热器、温度监测仪均由德国吕贝克医科大学Kerner教授实验室提供；酶膜及Teflon膜分别来自Yellow Spring器械公司和Universal Sensor ZNC；各种实验用化学品来自Sigma化学公司。
2.2 实验方法
2.2.1 葡萄糖恢复的检测
按图1连接脉冲式微泵和微透析探针、管道，其末端接一微管。将探针分别放入盛有5.5mM和10mM G.S.的烧杯中。每20分钟在微管和烧杯中同时分别采等量样本一次。每对样本均在Backman葡萄糖检测机上测定浓度。实验在此两种浓度的G.S.中各进行5次。
2.2.2 改良的YSI酶膜的制作
2.0%过氧化氢(Sigma (9284)20μl加入100μl的2.5%戊二FEB6液中，混匀，取60μl均匀滴于YSI膜的正面，37℃恒温器上干燥12小时。
2.2.3 输出电流与G.S.浓度间相关性实验
按图1连接整个系统。把微泵、流动室、探针及装有不同浓度G.S.的烧杯放入一密闭的金属箱，此箱与循环加热器相连，保持温度于37℃。分别在0和10mM G.S.中运行此系统30小时，所得基线稳定，则以2.5，5，10，20mM G.S.浓度为梯度进行渐增渐减实验，每一浓度试验1小时20分，从2.5～20mM G.S.为一个循环，共行12个循环。
2.2.4 抗干扰试验
在37℃让整个系统于0和10mM G.S.中分别工作12和30小时，性能稳定则从0.05，0.1，0.2，0.3mM的抗坏血酸或醋氨酚液(均不含G.S.)为梯度进行试验。每一浓度试验1小时20分。两种干扰物各试验3次。
2.2.5 温度实验
用温度监测仪监测金属箱内的温度。从20逐步上升至40℃，再渐降至20℃，每5℃为一梯度，每一温度保持1小时，同一系统分别在0和10mM G.S.中各进行一次则为一个温度实验循环。本研究共进行了3个循环。
各实验结果均用Sigma Plot 软件进行统计。
3 实 验 结 果
在5.5和10mM G.S.杯中各取5份标本及配对的经微透析采样的标本各5份，同在Backman机上测定、配对计算及统计分析，结果显示本系统微透析探针的葡萄糖恢复为97±2.2%，远高于Y.Hashigrouchi 35.6±0.2%的报道。〔3〕
图3显示0至20mM G.S.中，G.S.浓度与电极输出电流间均呈线性关系，其相关系数均值达0.986。
图3 传感器电流与葡萄糖浓度的相关性
本系统的体外特性如表1。背景电流较其他文献报告更低〔4〕，与Y.Haslugrocli等的相同〔3〕，均是至今报告中最低的。30小时的漂移值未见报道。5.5mM G.S.中测试24小时所得最低漂移值为0.255%-1mM-1h〔5〕，本研究10mMG.S.中测试30小时的漂移值为0.103%-1mM-1h。由于G.S.浓度越高，传感器运行时间越长，其漂移程度越明显，所以本组的结果是迄今为止报告的最低值，且意义更大。 
表2的抗干扰结果显示：0.1mM的抗坏血酸与电极输出电流无相关性。较高浓度的抗坏血酸和各浓度的醋氨酚液均只引起微小的干扰电流。
从图4、5中可见在双蒸水中，传感器输出电流随温度升高而增加，此种现象在10mMG.S.时更明显，但同一温度值时输出电流值较接近。 
图4 0mMG.S.中温度实验 图5 10mM G.S.中温度实验
三次10mMG.S.温度实验中的温度系数分别为3.63%、2.96%、3.63%。其计算公式如下： 
式中：Itmax、Itmin和It35℃分别为最高温度、最低温度和35℃时的稳态电流值；tmax、tmin为最高和最低温度。
4 讨 论
20多年来许多专家致力于持续监测血糖的研究，但存在以下问题：一、微透析膜两侧物质扩散不充分，使葡萄糖的恢复不完全。半透膜的物质扩散与两侧的物质浓度梯度和持续时间有关。二、上述不完全性影响了测量的准确性，因而需用体内两点法来校正〔6〕。即在病人身上人为地造成高、低血糖状态。这对危重病人来讲是十分危险的，并需较长的检测前校正时间而不具及时性。三、持续监测时血糖浓度信号连续变化不断，难免前后信号互相干扰，影响检测的准确性和可信性。最后，持续监测血糖需携带较多的缓冲液，不利于小型化。我们从实际需要考虑，提出间歇监测血糖的新思路，采用脉冲式微泵，使前后电信号相隔20分钟发出。图2已示本传感器电流20分内已稳定于基线，达到避免前后电信号互相干扰的目的。改良的YSI膜在这方面也有贡献。当只存在GOD时，电极阳极端汲出电子的过程相对缓慢，故峰电流回基线需数十分钟，其间第二个峰电流已发出，因前者未达基线，故从较高水平开始上扬，出现干扰。改良的YSI膜中加了过氧化氢酶，加快了电子汲出过程，使在瞬间产生快速上扬和下降的峰电流并很快达基线。这一结果使电极输出电流与G.S.浓度间的直线相关性更好、更可信。未采用改良的YSI膜时，系统的背景电流为0.7±0.2nA，电极输出电流与G.S.浓度间的直线相关系数为0.92〔4〕，此事实也支持上述分析。脉冲式微泵24小时泵液1.44ml，回收的残液更少，使传感器系统更小；与微透析技术结合应用，几乎达到葡萄糖完全恢复，故不需体内校正，更安全、方便和及时。从临床来讲也无须每分每秒监测血糖，因血糖的较大波动、药物作用的发挥都需一定的时间。
在体外实验中，影响电流漂移最主要的因素是传感器的结构和传导层。理想的漂移结果提示本传感器结构合理及改良酶膜的重要。因为GOD固定于膜及第二种酶(如过氧化氢酶)的使用可改善传感器的稳定性是众所周知的〔2〕。
虽然GOD对β-D-G.S.是非常特异的，但这种特异性被电极的不良选择性所减低。在适当的电压范围内，电极能氧化所有存在于液体中的可氧化物质。因而必须限制干扰物进入传感器。血液和组织液中的许多生化物质和药物，如抗坏血酸和醋氨酚，或通过电极的氧化，或通过与G.S.产生的过氧化氢发生反应而干扰传感器的功能〔8〕。本系统采用了Teflon膜及改良的YSI膜，对上述干扰物的各个干扰环节均能发挥限止作用。尤其是改良的YSI膜能在瞬间分解过氧化氢，因而在减少过氧化氢与干扰物起反应的机会中具有重要意义。人体血液抗坏血酸的正常范围是23～85μl〔9〕；服药者血液中醋氨酚为13～40μl。本组抗干扰实验所用的浓度均超过上述值数倍至数百倍，但其最大干扰电流也小于10mMG.S.电流的4%，可以忽略不计，证实本系统具有较强的抗干扰能力。
葡萄糖传感器输出电流随温度的升高而增大是酶电极传感器的特性。这种特性干扰了传感器对发热病人血糖监测的准确性，限止了它的临床应用。本研究所得的温度实验结果显示其在20至40℃双蒸水中，输出电流最大变化也小于4nA，无干扰意义。同一温度时电极输出电流有些差异，主要由金属箱温度传递差异和G.S.在温度增高时水份蒸发所致，故不影响实用。在G.S.中由于酶在接近最佳功能温度时(GOD与过氧化氢酶为37℃)活性明显增加，所以存在干扰电流。据此，我们以温度——输出电流呈直线关系为假设，以35℃为基本条件(正常人S.C.温度多在35℃左右)，计算得温度系数为3.4%左右(10mMG.S.中)，即温度每升高1℃，输出电流增加3.4%。尽管从图4、5中知道温度—输出电流间并非直线关系，但知道温度系数的大致范围后可采用各种方法(如曲线补偿法、计算机程序补偿法等)补偿两者间的大部分偏差。加之体温高于40℃时，S.C.仍很少超过40℃，故实际的温度变化更小。另外，高热时糖尿病者往往有严重并发症，后者使血糖大幅度增加，相比之下，经大部分校正后的温度所引起的输出电流的增加就显得不重要了。因此，本系统在发热患者中确有应用价值。
5 结 论
我们在此介绍的葡萄糖传感器系统具有体积小，校正简便、安全、及时，传感器性质稳定、检测精度高和抗干扰能力强的特点，同时也有较理想的温度特性。此系统携带方便、应用范围广、操作简便安全，更符合临床实际需求。(end)
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(3/14/2005) |
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