pH：动态目标的变化是否在掌控之中？

作者：Sensorin公司 Jim Wilkins

欢迎访问e展厅 展厅 2 实验室仪器展厅 天平, 振动研磨机, 移液器, 生命科学仪器, 摇床, ... 对于很多工业生产过程来说，pH参数的监测和控制是生产工艺的关键步骤，但pH参数的控制在生物制药过程中更加重要，不可或缺。控制好细胞培养过程的pH参数是优化生物制药过程的参数及确保目标产品的质量和收率的关键。 但是不管是在生产的上游还是下游，控制的难点是：对pH参数很难准确的进行实时检测。因为微生物在新陈代谢的同时也在改变着其所处环境的pH值，同时也在影响着其生长过程的条件。此外，电极被污染或者在清洁消毒后不能进行正确的校准等情形都会造成pH测量值产生漂移从而影响读数的准确性。本文将讨论这些因素，以及为什么pH控制对于生物制药过程如此重要；并总结出一些实现pH控制的最佳实践；最后简单的论述如何控制pH才能符合生物制剂药品“质量源于设计”的要求。 在生物制药的下游工艺中，pH值(伴随一定的离子浓度) 是色谱分析法中缓冲流动相的一个关键特性，其对蛋白质的提纯起着决定性的作用。流动相和静止相之间的相互作用能影响色谱分析的功能，从而影响目标产品和杂质的分离。例如，在生产规模的生物加工过程中，产品提取、纯度和产量等指标受到生产培养过程中的缓冲液的制备和关键参数（比如pH）变化的影响，从而可能带来负面的影响结果。 因此，从配料到完成操作的工艺实施阶段过程中，自始至终必须严格的监测pH值。 典型的上游应用包括任何一个发酵过程的研发，优化和实施，即利用活的微生物例如酵母、细菌或者真菌发酵生产活性药物产品——或者利用动物细胞培养，即利用哺乳动物细胞来培养具有生物活性成分的药物制品。 微生物的发酵周期（一般2-7天）通常比动物细胞生长的周期更短一些（动物细胞通常为2周一批）。对于作为诊断和治疗用的蛋白质、病毒疫苗、体细胞和基因疗法来说，细胞外的pH值是一个极重要的过程参数。它必须跟其他参数比如媒介浓度和氧含量一样，通过实施优化控制来获得我们想要的产品特性。必须对细胞外的pH值进行有效的控制，才能确保细胞产品或者其衍生物的培养结果的高质量和连续性。 pH值控制是极富有挑战性的，因为有机物的新陈代谢会改变其周围环境的pH值。通常来说，影响pH的典型因素主要包括以下几个方面： * 碳水化合物在发酵结束后产生的有机酸（乳酸、乙酸、丁酸等）； * 含氮化合物，包括氨基酸生成的氨，尤其是当介质成分中氮:碳的比例高于1:4时，pH值易升高； * 培养介质中二氧化碳的产生和碳酸的增加； * 有机酸（如琥珀酸）的阴离子的消耗会提高pH值。 因此在实验室和工业生产工艺中对细胞培养介质的pH值的管理和控制是一个重要的环节。通过许多研究发现，实验室培养的细胞生长以及合适的培养介质的开发有赖于连续完善的pH控制、适当的参数微调或保持pH值不变。 培养基控制 大部分细胞培养基包含有可提供pH缓冲的成分，这是非常理想的，因为许多细胞的生长受很窄的pH范围的限制。通常使用酸（例如二氧化碳）和碱（例如碳酸钠）来使pH保持在设定值的± 0.03pH范围内。 在对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养中的pH值进行测量时发现，当早期细胞密度低时，pH的变化可以忽略不计，当培养进行至大约60小时左右时，pH开始迅速下降，然后稳定不再变化。 培养基的pH值可以影响细胞的功能和性质，包括：细胞繁殖，细胞分化，新陈代谢，细胞内的pH，氨对细胞的影响，蛋白质糖基化，蛋白质合成，抗体生成，核糖核酸（RNA）酶的含量，酶的分泌、谷氨盐的合成和分解。综上所述，在动物细胞培养生产过程中，pH控制非常有必要。 最近的一项研究表明，在无蛋白质的培养介质中，对典型的哺乳动物细胞（包括白鼠骨髓瘤，NSO和 CHO）进行培养，当pH在7.0到7.3之间时，培养细胞的数量和产出率都比较高。结论表明上下0.3 pH的变化范围可以成倍的影响细胞的产率。此外，当细胞在正常的培养条件下，降低pH值能减少葡萄糖的利用率和乳酸的积聚率。 一个较低的特定的葡萄糖利用率被认为是有益的，因为它可以减少一部分培养基中葡萄糖的数量，还可以简化饲料配方和添加方法，而较低的特定的乳酸积聚速率也同时降低了整体环境中的乳酸浓度，从而在控制pH值方面降低了中和用的碱性物质需求，从系统上简化了过程操作，并改进了过程的鲁棒性。 在细胞表达水平方面的影响 生化生产上遇到的另一个挑战是，每个个体的细胞株需要优化自己特有的最佳允许范围，因为在不同的细胞株之间也存在着显著的差异。所以虽然绝大多数的生物反应器都是利用CHO细胞，但仍然需要对pH值进行优化。 有些研究也关注pH值对关键细胞的表面蛋白质的表达水平方面产生的影响，重要的是那些细胞的表面蛋白质参与了关键功能的调解，如病毒的传染，癌症细胞的识别等。有实验证明：细胞外pH值的变化也可能改变某些细胞表面受体的表达水平。同时，降低细胞外的pH值会导致HL60细胞内CD13的表达增加，而对CD13的mRNA的水平没有影响。这表明细胞外的pH值在蛋白质合成或蛋白质运输到细胞表面方面是有影响的。此外，细胞外pH值的降低也深刻影响着细胞的新陈代谢。细胞培养在pH值7.0和7.2时表现出的葡萄糖消耗和乳酸生产率比培养基pH值为7.4时要降低20%-40%。 降低培养基的pH值会降低葡萄糖消耗和乳酸生产速度，这一趋势也被对HeLa（人子宫颈癌传代细胞）细胞和杂交瘤细胞所做的实验所证实。一项研究发现：随着培养基的pH值从7.6降到6.8，杂交瘤细胞表现出生长率降低，以及葡萄糖消耗和乳酸生产率降低。另一个对比实验是通过观察HL60细胞的培养，当培养基的pH值从7.4降到7.0时，HL60生长率基本上未受影响，但是观察也发现葡萄糖消耗和乳酸生产速度降低了20-40%。 总体收益率更好的原因可能是在pH值较低情况下，细胞对其他营养素的利用率更高，从而降低了代谢能量的需求(包括细胞修复)，或者更有可能的是，复杂的事件可能会涉及几个代谢和膜过程。 显然，在哺乳动物细胞的大规模培养时，pH值是一个重要的生物工艺参数，因为它会影响细胞生理学，蛋白质表达与品质，细胞分化等许多方面。 糖基化产品 蛋白质的糖基化在蛋白质治疗药物的有效性方面是至关重要的。带有N-乙酰基神经氨酸(又名唾液酸)的N-联-糖基化蛋白治疗药物，是一个用于产品质量评估的典型标记物，其中N-乙酰基神经氨酸(又名唾液酸)可改善药物的循环半衰期。目前市场上的糖基化产品包括许多重磅炸弹类药物，如：Avastin、Enbrel、Erbitux和Herceptin等等。对于监管者来说在生产中获得稳定一致的糖型结构至关重要。完整描述一个分子治疗药物的通常做法是结合使用酶法、液相色谱分析法和质谱法来彻底描述其碳水化合物结构。 哺乳动物细胞的表达系统，特别是CHO细胞，是生产商业用糖基化蛋白的首选方法。因为他们是一种天生的加工机器，包括蛋白质的糖基化，而且非常类似于人类的细胞。然而，细胞类型、培养过程和媒介等因素对糖基化结构具有关键性的影响。大多数的影响作用是通过影响发生在宿主细胞内的代谢过程，这些代谢过程pH值极度相关。例如，作为谷氨酰胺和天冬酰胺代谢的副产品，铵离子可以驱动细胞内pH值增加和降低末端唾液酸化作用，这一作用反过来可以极大地影响药代动力学和功效。 经发现生物反应器中的pH值也会影响蛋白糖基化。例如，在杂交瘤细胞内，pH值变化对单克隆抗体的半乳糖基化和唾液酸化作用都有影响。pH值增加到7.4及以上，似乎可以促进在HEPES缓冲培养基中半乳糖复式聚糖的生长，而pH值降低则促进形成单一或乳糖复式聚糖。 通过降低培养基的pH到最优的pH值区间6.8- 7.2，可以促进红细胞生成素中酸性亚型比例的增加，顺利实现唾液酸化的作用。不过需要注意的是，有时pH值的影响并不总是向着一个方向变化的，在CHO细胞表面，如果存在一个更高的pH值，则对多唾液酸附加到神经细胞粘附分子的表达可能会有相反的效果。 干细胞培养 随着干细胞作为潜在治疗药物的重要性日益提高，人们对于了解和优化干细胞加工的兴趣更加浓厚。几乎所有的哺乳动物细胞培养都是在理想的标准条件下(pH值为7.4，20%的氧气，5%二氧化碳，37°C)，但不同的细胞培养基对于干细胞的繁殖和分化有着不同的最佳状态。例如，更高的pH值(pH值7.6)被发现可以提高巨核细胞的干细胞分裂和成熟，同时也有利于红细胞的分化。但相反，对于粒细胞生成来说，在低pH(pH值为7.21)下更佳，因为低pH能够提高粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的表达和粒细胞的增殖和分化。 除非是对pH进行正确的控制，否则细胞质量和/或一致性方面的问题将可能会非常多。但是有效的pH值控制并不一定总能很容易实现，因为pH的变化会造成细胞培养基空间的非均匀性。此外，细胞外的pH值可能随着培养基的不同而变化剧烈，尤其在细胞密度增加时。最近的研究显示，T型玻璃瓶中的中国仓鼠纤维母细胞，在6小时的培养时间内，尽管大环境的pH值保持在7.6，但其局部环境的pH值有时仍可能为6.5。显然，在生物反应容器中需要使用温和的搅拌来提供出更均匀的细胞外同质性环境。 研究人员通过进一步的实验发现，在一个中空纤维反应器系统中存在养分浓度梯度，这种现象可能最终会形成整体环境的pH值梯度和溶解氧梯度。研究表明，不同培养基的pH值对细胞的功能和属性存在不同的影响。 蛋白质聚集 实现精确的pH值控制也可以帮助减少在生物制药生产中常见的蛋白质聚集现象。蛋白质聚集可能会表现为许多形式。例如，可逆蛋白质聚集就是相对较弱的共价蛋白质相互作用的结果，这种相互作用不断的调整单体和高阶形式两者之间的平衡。这种平衡很容易被细胞外的一个简单的pH值的改变而打破。 传感器功能和数据漂移 在生物加工时对pH值进行测量的另一个挑战是清洗过程。一个发酵罐或生物反应器在开始下一个生产过程前必须经过清洗和消毒处理，以确保不会发生批次交叉污染或有害的微生物污染。此外，由于pH值传感器的校准方法需要使用缓冲液进行两点校准。但是传感器上残余的缓冲液化学品必须在批生产前除去。原位清洗 (CIP)应该先于原位蒸汽消毒(SIP)步骤。尤其注意的是在高温蒸汽消毒时，由于暴露于高温蒸汽中并经受剧烈的热冲击，pH传感器功能会受到显著的影响。 不同的培养批次有不同的最佳控制设定值，在同一批次的不同培养阶段pH值也可能会改变。使用经典的玻璃pH电极时，存在许多因素可能导致pH测量值发生漂移，从而减弱测量值的可信度。这些影响因素包括电极被污染或参比电极结垢钝化。 一个安装在反应器上的pH传感器经过消毒之后就不能再进行两点缓冲液校准了，因为电极不能被重新拿出来进行标准缓冲液校准。因此，最终的结果是执行更频繁的离线pH测试，然后整理出在线测量和离线测量的对应关系，并使之标准化(即：一点校准)。这种校准方法使用在更长的生产批次时更为必要，当然这需要训练有素的人员在现场去正确执行这一任务。 一旦一个有治疗作用的蛋白质从一个细胞培养载体(或其它表达系统)生产出来，它必须被进一步提纯，以减少或消除宿主细胞蛋白质、病毒和生产过程中可能产生的相关杂质。为了提纯和浓缩所需的蛋白质，可使用正交提纯技术，这种技术利用分子之间存在的亲合力、电荷、大小或其他属性方面的差异，将需要的成分和不希望的成分区分开来。 在这个过程中，蛋白质将经历一个pH值、离子强度和浓度的大范围改变。以上这些都是至关重要的，因此必须密切控制目标蛋白质以防止其在生产过程中流失（如蛋白质的聚集）。 符合QbD原则 按照质量来源于设计(QbD)的原则，实施过程分析技术(PAT)来促进生物制药过程是至关重要的。过程分析技术(PAT)可以保证那些要求严格的过程环境参数的一致性，如pH值等。在过去的10年里，许多蛋白表达的效价增加了1000倍达到g/L的范围。因此其下游的生物工艺，包括缓冲液准备和交付等不得不进行相应比例的增加以便保持与之同步增长。同样的，随着更先进的技术和工艺的出现，大量的高精度工业级生物反应器的生产和提供，对于反应器培养过程中的关键性参数如pH值的反馈控制等就变得更加重要。 在蛋白质的纯化和分离过程中，离子交换柱的利用是一个关键环节。离子交换柱分离蛋白质的功能是利用蛋白质在一个特定的pH值条件下的净表面电荷，基于带电的蛋白质和一个带相反电荷的层析介质之间可逆的相互作用。以下几点需要重点考虑: * 蛋白质具有0净电荷：pI = pH值 不会与带电介质结合； * 蛋白质pI < pH值 将与一个带正电的介质或阴离子交换剂结合； * 蛋白质pI > pH值 将与一个带负电的介质或阳离子交换剂结合。 使用一个连续或逐步的盐梯度或者pH梯度可以对蛋白质进行洗脱。pH值梯度分离需要1-2个单位的pH值改变以分隔两种带不同电荷的蛋白质。酸和碱之间的滴定曲线，无论是强还是弱，都不是线性的。因此在层析法中具有类似pI的蛋白质的分离时避免采用pH梯度。 通常的，弱酸（如醋酸）和弱碱（如氢氧化铵）混合时，当使用质量流量时混合的结果表现为s形滴定曲线陡峭的上升，在非常短的时间内pH值从6.5升到pH值9。然而，经过证实，当使用一个基于PAT的包含有精确地加酸调节的反馈控制系统时，可以生成一个线性的pH值梯度，这样的话就能促进更高效的层析分离。 总之，pH值的测量在生物制药生产的所有方面都扮演着重要角色。在cGMP强制性条款的要求下，精确的pH控制是保证生产保持高质量标准的必要条件。一次性生产技术的引入为pH传感器制造商带来了一个新的挑战。新技术的推出正紧跟行业快速发展的需求。 作者介绍： Jim Wilkins先生在2009年加入Sensorin公司，担任公司的首席技术官。此前，他作为耶鲁大学化学工程教授，曾在基因技术公司担任技术评估和技术审批主管，并担任过Alexion制药公司的副总裁负责工艺的开发和制造。(end)

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