细胞外信号调节激酶(ERK)的总量通过联合分析对兔抗-ERK和IRDye800 CW标记的羊抗兔抗体而得到。含磷的ERK的量通过含磷的鼠抗ERK和Alexa Flour 680标记的羊抗鼠的量进行计算。在EGF存在而PD168393 不存在的情况下,细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化作用有了实质性的增加。依赖于加入样品的PD168393 的剂量的多少,观察到了磷酸化作用的剂量的相关减小。根据ERK总量标准化处理过的ERK的磷酸化作用确保了准确、可重复定量测定PD168393 的效用以及测定药物的50%抑制浓度。In-Cell Western 可以得到PD168393 准确的IC50值,其值与文献中所叙述的IC50值相符。
总结
In-Cell Western Assay依赖于双色的红外检测;可以得到准确、高度可重复的实验数据;而且和Western blotting相比,不需要密集的工作,也不存在由于细胞提取所带来的潜在的假象。避免进行细胞提取这点尤为重要,因为有些含磷蛋白质是不稳定的,在处理过程中的去磷酸化会导致错误的结果。与基于酶-底物的化学反应的化学发光法不同的是,红外荧光检测是一种有着超过4000-fold 线性范围的直接定量方法。In-Cell Western 检测可以以便利的微量滴定板的形式,在不需要细胞提取和电泳分离的情况下,对药物作用于蛋白质激酶靶体的效果做出准确的定量评价。事实将证明,这种检测方法在检验激酶抑制药物功效中是非常有用的。(end)