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利用ASE和HPLC快速高效地分析皂苷类有效成分 |
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作者：戴安（上海）应用实验室 陈静 来源：PROCESS《流程工业》 |
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戴安公司（DIONEX）的加速溶剂萃取仪（ASE）和高效液相色谱仪为人参、西洋参和三七等药材中皂苷类有效成分的提取、分离及药材的鉴别提供了一个快速、自动且高效完整的解决方案。
五加科人参属植物人参、西洋参和三七均为名贵药材，广泛应用于临床。人参性平，味甘微苦，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神、益智等功效；西洋参性凉、味甘微苦，功能以补气养阴，散热生津为主，可滋阴降火；三七性温，味甘微苦，可散瘀止血，消肿定痛。这三种药材均具有多方面的药理和生物活性，含有多种类型的化学有效成分，如皂苷类、多糖类、多肽类、脂肪酸、氨基酸等，其主要活性成分为中极性部分的皂苷类成分。
目前，人们已经从人参（白参、红参）及其地上部分得到了近40种人参皂苷，一般将总皂苷称为人参皂苷Rx，按硅胶薄层色谱Rf值的大小顺序，由小到大命名为Ro、Ra、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Rh2、Rh3 … …。
根据苷元的结构分为A、B、C三类（图1），A型和B型人参皂苷结构母核为四环三萜达马烷型，是达马烯二醇的衍生物，二者C20的构型均为S型。A型人参皂苷的苷元为20（S）-原人参二醇，B型人参皂苷的苷元为20（S）-原人参三醇。C型人参皂苷结构母核为五环三萜齐墩果烷型。
图1 苷元的结构分为A、B、C三类
ASE（快速溶剂萃取仪）
目前这三种药材的活性成分大多是采用传统的萃取-净化-浓缩提取方法，中间过程复杂繁琐，损失大且效率不高。采用戴安公司的ASE（快速溶剂萃取仪），通过提高温度，使用尽可能少的溶剂，可在尽可能短的时间完成萃取过程，在20min内完成对多种参类样品目标分析物的自动快速提取。与传统的提取方法相比，其具有耗时短、步骤少和效率高等特点，而且所得的多数样品溶液基本无需净化处理，可直接在液相色谱仪上进样分析。
ASE是一种使用很少量的液体溶剂或溶剂混合物，通过升高温度和压力，在很短的时间内完成对固体或半固体样品萃取的一种提取方法，已得到广泛应用。它把传统的萃取时间从以天或小时为单位计算降低到仅用几十分钟, 甚至十几分钟，可以在无人值守的状态下自动连续萃取，大大提高了实验室工作效率；另外，ASE是一个全封闭系统，保证了操作人员的健康和安全。此方法可与传统索氏提取、超声和振摇萃取等方法兼容。
样品的提取方法
样品准备：分别将2g人参、西洋参和三七样品磨成粉末状与硅藻土混合后装入5ml的ASE萃取池。也可在ASE萃取池底部铺上一层氧化铝，来吸附色素、脂类等杂质，使色谱的干扰峰减少，但需要进一步的条件优化，以免皂苷类目标分析物也被吸附。
仪器：ASE 200型加速溶剂提取仪。
ASE条件：140℃温度；甲醇静态萃取5min；循环2次。
液相色谱的分离方法
Dionex UltiMate 3000高效液相色谱系统，包括在线脱气机（SRD3400），高压四元梯度泵（HPG3400），自动进样器（WPS3000TSL），柱温箱（TCC3000）和紫外检测器（VWD3400）。色谱柱为Acclaim 120 C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5μm）。色谱条件：柱温50℃；检测波长203 nm；乙腈水梯度洗脱。
结果与讨论
２g样品的 ASE提取液大约有25ml左右，定容至40ml后可直接用于分析。即使不用浓缩步骤，也可以得到很高的色谱峰，这说明ASE的提取效率相对于其他技术有明显提高。
现有方法通常利用高效液相色谱对皂苷类成分进行分析，大多耗时极长。例如2005版中国药典中，分离三七样品的梯度是60min，而分离人参和西洋参样品的梯度均长达100min。戴安公司的UltiMate 3000高效液相色谱仪用同样的ASE提取手段及色谱方法，在反相C18色谱柱上仅用25min即分别完成三种不同药材（人参、西洋参和三七）中15种主要皂苷类物质的分离，大大缩短了分离时间，同时也显著降低了溶剂消耗。
使用高效液相色谱并采用紫外末端203 nm作为检测波长，是最为广泛的皂苷类的测定方法。相对于2005版药典的规定方法，本方法只需简单地改变梯度和柱温。
图2 15种常见皂苷类标样的分离色谱图
图2为在前述色谱条件下25min梯度内对15种常见皂苷类标样的分离。它们包括人参皂苷：Re（2）、Rg1（3）、Rf（4）、Rb1（5）、Rc（6）、Rg2（7）、Rb2（8）、Rb3（9）、Rh1（10）、Rd（11）、Rg3（12）和Rh2（14）；皂苷元：原人参二醇（15）、原人参三醇（13）；三七皂苷R1（1）。
Re与Rg1是重要的人参皂苷，结构极为相似，是较难分离的两个皂苷。试验表明，在Acclaim 120 C18色谱柱上，随着温度的升高，Re与Rg1分离度增大。因此，柱温选定为50℃。
图3~图5分别为人参、西洋参和三七药材样品的色谱图。图上标出了2005版药典要求的人参皂苷Re、Rg1、Rb1及各自的特征皂苷。人参皂苷Rf （图2）是人参区别于西洋参的特有皂苷；另外，也可根据人参皂苷Re和Rg1的比例来区分人参，西洋参和三七：人参中Re:Rg1≈1:2，西洋参中Re:Rg1≈10:1，三七中Re:Rg1≈1:10。三七皂苷R1是三七的特有皂苷 （图5）。
图3 人参样品的色谱图
图4 西洋参样品的色谱图
图5 三七样品的色谱图
另外，也可以利用本方法制作快速、简单、可信度高的人参、西洋参和三七的指纹图谱，用来鉴别药材质量的好坏，以及不同批次、产地和收集时间的药材的质量差异。(end)
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(1/9/2008) |
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