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利用RRLC改善西洋参HPLC的分离速度和灵敏度
作者:安捷伦科技有限公司    来源:PROCESS《流程工业》
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本文以中国药典的HPLC方法为起点,利用快速高分离度液相色谱(RRLC)对西洋参中活性组分Rg1、Re、Rb1进行快速、有效的分离。该方法在保持分离度和重现性的前提下,改善了分析灵敏度,大大缩短了分离时间。另外,使用相同RRLC系统和与RRHT色谱柱相同键合相的ZORBAX SB C18 HPLC色谱柱,也获得了满意的HPLC分离结果。

概述

西洋参(又名花旗参)系五加科植物西洋参(Panax quinquofolimm L.)的干燥根,西洋参的根部及地上茎叶部分含有多种生理活性成分,其中主要是西洋参皂甙和三萜类化合物,三萜类化合物与人参皂甙结构相似。西洋参皂甙是西洋参中主要的有效成分,也是生理活性最显著的物质。其中人参皂苷的Rb1又是西洋参主要特征成分,其含量高于人参,也是西洋参与人参鉴定的主要依据。

在2005版中国药典一部中,西洋参活性成分的含量测定采用了以十八烷基键合硅胶为填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱的液相色谱分析方法。该方法主要需要分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1,因3个化合物结构相似,尤其是Rg1和Re(见图1),故HPLC需要利用长时间的浅梯度分离。3个色谱峰的HPLC分离时间需要约60min,分离一次的运行时间长达120min。本研究是在中国药典HPLC梯度方法的基础上,选择合适的键合相填料,开发以小颗粒填料技术为基础的RRLC方法,在满足分离度要求的前提下,实现快速、灵敏、可重现的方法学目标。

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图1 人参皂苷的结构

在2005版中国药典一部中,西洋参活性成分的含量测定采用了以十八烷基键合硅胶为填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱的液相色谱分析方法。该方法主要需要分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1,因3个化合物结构相似,尤其是Rg1和Re(见图1),故HPLC需要利用长时间的浅梯度分离。3个色谱峰的HPLC分离时间需要约60min,分离一次的运行时间长达120min。本研究是在中国药典HPLC梯度方法的基础上,选择合适的键合相填料,开发以小颗粒填料技术为基础的RRLC方法,在满足分离度要求的前提下,实现快速、灵敏、可重现的方法学目标。

RRLC方法转换和优化

快速高分离度液相色谱(RRLC, Rapid Resolution Liquid Chromatography)利用亚二微米小颗粒填料分离的液相色谱技术,与常规较大颗粒(如5mm)不同,小颗粒可以显著改善液相色谱的分离度、分离速度和灵敏度。因RRLC分离常常使用与HPLC不同的仪器和色谱柱,故在RRLC分离时需要对原始HPLC分离条件进行适当的调整或优化。

色谱柱的选择

因流动相中含有磷酸,RRLC分析采用内含1.8小颗粒的ZORBAX StableBond C18色谱柱。该填料在低pH条件下具有杰出的稳定性,是低pH条件液相色谱分离的首选。色谱柱规格选择了4.6×50mm的RRHT色谱柱,其柱长与粒径之比(L/dp≌28)与规格为4.6×150 mm, 5的常规HPLC色谱柱相当(L/dp=30),故可以获得相近的分离效率,但分离速度大大提高,并且可以改善灵敏度。

色谱柱内径的选择主要考虑方法转换的方便性,选择与HPLC色谱柱相同内径的RRHT色谱柱可以降低方法转换的可变性。本方法采用了与HPLC色谱柱相同内径(4.6mm)的RRHT色谱柱。如选用更小内径的色谱柱,可以在保持线速度相同的前提下获得相同的分离结果,并进一步降低溶剂消耗。

方法转换的初步参数确定

在Method Translator相应栏目中输入原始HPLC条件,包括HPLC色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数,并选择RRLC色谱柱的规格,即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的RRLC分离的初步参数。

因小颗粒填料在较高的线速度下可以保持柱效(分离度),故可以通过提高流速的方式进一步提高分离速度。如需保持分离度相同,则在流速调整时要保持流速与梯度时间乘积不变,即提高流速的同时等比缩短梯度时间。本研究根据中国药典一部中给定的西洋参梯度分离条件和上述原则,确定了初始实验条件。

方法优化

起始试验条件虽然获得了与药典原始HPLC方法相似的RRLC分离谱图,但因色谱柱选择性的差异等影响,并没能基线分离结构相近的目标化合物Rg1与Re。因此,方法需要进行进一步摸索与优化。适当降低流动相在Rg1与Re出峰附近的洗脱强度,两色谱峰的分离度获得了初步改善,但仍未实现基线分离。考虑到温度对分离选择性的可能影响,尝试设置不同柱温考察分离选择性的变化。原始中国药典的方法所用柱温为40℃,本实验在原始条件的基础上,又分别在25℃和30℃下进行了分离(见图2)。

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图2 不同温度下,Rg1与Re的分离度比较

从实验结果得知:降低温度有利于Rg1与Re的分离,25℃时Rg1和Re可以得到基线分离(分离度>2.0)(见图3),故最终选择25℃为柱温条件。最终优化获得的分离条件可以在11min内基线分离3个目标皂苷(分离度>2.0),加上洗脱保留较强杂质与平衡时间,一次运行总时间为20min,分离速度是原来HPLC分离速度(120min)的6倍,溶剂消耗也相应降低了。

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图3 西洋参中人参皂苷的RRLC分离结果

RRLC色谱条件

系统:Agilent 1200快速高分离度液相色谱(RRLC),包括:在线脱气机(G1379B),SL型二元泵(G1312B),SL型自动进样器(G1367C),SL型柱恒温箱(G1316B)和SL型二极管阵列检测器(G1315C)。

检测池:2μl
峰宽:0.01min(0.2s)
狭缝:4nm
进样器后管线内径:0.12mm(Seat Capillary为0.17mm)
色谱柱:ZORBAX SB C18 RRHT色谱柱,4.6×50mm,1.8
流动相:A为0.1%的H3PO4,B为乙腈,梯度分离
柱温:25℃
流速:2ml/min
检测波长:203nm
进样量:5μl

RRLC分离的梯度重现性

使用RRLC系统进行快速分离不仅可以获得速度、分离度与灵敏度的改善,同时可以保持液相色谱分离技术的杰出重现性(见图4)。

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图4 西洋参分析中RRLC梯度分离的重现性,色谱条件同图3

RRLC和HPLC的转换

RRLC的良好兼容型与灵活性,使用户可以根据需要在同一仪器硬件上灵活使用常规HPLC色谱柱和RRLC色谱柱。而键合相品牌丰富的ZORBAX RRHT色谱柱(如SB、XDB、Extend、Eclipse Plus等),又为相同品牌、不同粒径填料之间方法的相互转换提供了便利条件,使RRLC与HPLC之间方法的相互转换非常方便。基于现有RRLC分离条件,也可以非常容易地获得相应HPLC的分离方法。只需用Method Translator将参数进行直接转换,即可获得根据RRLC方法优化参数相应的HPLC条件参数。本研究使用相同的RRLC系统和HPLC色谱柱,获得了分离选择性与RRLC几乎完全相同的HPLC分离结果(见图5)。

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图5 西洋参分析中HPLC与RRLC分离色谱图比较

值得注意的是:与RRLC相比,HPLC在相同进样量时获得的色谱峰高较低,故相对灵敏度较低。同时,分离时间也大大加长,溶剂消耗亦相应提高。

讨论与结论

-中国药典的药物分析方法中并未指定色谱柱品牌。而不同品牌、相同键合相的色谱柱又存在不同的选择性差异,故直接应用药典方法时往往需要对方法进行调整或优化,尤其是对于复杂样品的分离而言。使用小颗粒短柱的RRLC分离可以显著加快分离速度,故可以大大缩短方法开发和优化过程所需的时间。如此获得的RRLC分离条件,又可以简单方便地转换成常规HPLC方法,并在RRLC系统上实现HPLC分离。所以,使用RRLC系统进行分离会大大提高工作效率。

-RRLC分离不仅可以大幅度缩短分析时间,而且能够降低溶剂消耗。

-RRHT色谱柱拥有与常规HPLC内径相同的4.6mm色谱柱,使之可以接近或保持与HPLC相同的进样量。与HPLC相比,在保持相同进样量的前提下,使用小颗粒填料的RRLC可以显著改善分离灵敏度。

-RRLC可以在快速分析中仍然保持出色的分离重现性。

-不同色谱柱具有不同的选择性,因而可以造成方法转换中的分离状况变化。选择具有相同键合相品牌的不同颗粒色谱柱,会简化HPLC与RRLC方法之间相互转换中的参数优化过程。ZORBAX系列RRHT色谱柱涵盖了非常丰富的键合相品牌,如SB、XDB、Eclipse Plus、Extend等,方便用户灵活选择与HPLC相同品牌键合相的小颗粒填料。

-温度对色谱柱选择性的调节作用不可小视。RRLC具有制冷功能的柱温箱,不仅温度控制范围宽(室温以下15~100℃),而且控温精确高(±0.05℃),即便在室温以下亦能精密控温。快速、精确的温度调节与控制能力,不仅保证了分离的保留时间重现性,而且为用户利用温度进行选择性调节提供了极大的便利。

色谱条件
色谱柱:ZORBAX SB C18 4.6×150mm,5
流动相:A为0.1%H3PO4,B为乙腈,梯度分离
流速:1ml/min
其它条件同图2。(end)
文章内容仅供参考 (投稿) (如果您是本文作者,请点击此处) (1/9/2008)
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