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利用RRLC改善西洋参HPLC的分离速度和灵敏度 |
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作者：安捷伦科技有限公司 来源：PROCESS《流程工业》 |
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本文以中国药典的HPLC方法为起点，利用快速高分离度液相色谱（RRLC）对西洋参中活性组分Rg1、Re、Rb1进行快速、有效的分离。该方法在保持分离度和重现性的前提下，改善了分析灵敏度，大大缩短了分离时间。另外，使用相同RRLC系统和与RRHT色谱柱相同键合相的ZORBAX SB C18 HPLC色谱柱，也获得了满意的HPLC分离结果。
概述
西洋参（又名花旗参）系五加科植物西洋参（Panax quinquofolimm L.）的干燥根，西洋参的根部及地上茎叶部分含有多种生理活性成分，其中主要是西洋参皂甙和三萜类化合物，三萜类化合物与人参皂甙结构相似。西洋参皂甙是西洋参中主要的有效成分，也是生理活性最显著的物质。其中人参皂苷的Rb1又是西洋参主要特征成分，其含量高于人参，也是西洋参与人参鉴定的主要依据。
在2005版中国药典一部中，西洋参活性成分的含量测定采用了以十八烷基键合硅胶为填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱的液相色谱分析方法。该方法主要需要分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1，因3个化合物结构相似，尤其是Rg1和Re（见图1），故HPLC需要利用长时间的浅梯度分离。3个色谱峰的HPLC分离时间需要约60min，分离一次的运行时间长达120min。本研究是在中国药典HPLC梯度方法的基础上，选择合适的键合相填料，开发以小颗粒填料技术为基础的RRLC方法，在满足分离度要求的前提下，实现快速、灵敏、可重现的方法学目标。
图1 人参皂苷的结构
在2005版中国药典一部中，西洋参活性成分的含量测定采用了以十八烷基键合硅胶为填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱的液相色谱分析方法。该方法主要需要分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1，因3个化合物结构相似，尤其是Rg1和Re（见图1），故HPLC需要利用长时间的浅梯度分离。3个色谱峰的HPLC分离时间需要约60min，分离一次的运行时间长达120min。本研究是在中国药典HPLC梯度方法的基础上，选择合适的键合相填料，开发以小颗粒填料技术为基础的RRLC方法，在满足分离度要求的前提下，实现快速、灵敏、可重现的方法学目标。
RRLC方法转换和优化
快速高分离度液相色谱（RRLC， Rapid Resolution Liquid Chromatography）利用亚二微米小颗粒填料分离的液相色谱技术，与常规较大颗粒（如5mm）不同，小颗粒可以显著改善液相色谱的分离度、分离速度和灵敏度。因RRLC分离常常使用与HPLC不同的仪器和色谱柱，故在RRLC分离时需要对原始HPLC分离条件进行适当的调整或优化。
色谱柱的选择
因流动相中含有磷酸，RRLC分析采用内含1.8小颗粒的ZORBAX StableBond C18色谱柱。该填料在低pH条件下具有杰出的稳定性，是低pH条件液相色谱分离的首选。色谱柱规格选择了4.6×50mm的RRHT色谱柱，其柱长与粒径之比（L/dp≌28）与规格为4.6×150 mm， 5的常规HPLC色谱柱相当（L/dp=30），故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度。
色谱柱内径的选择主要考虑方法转换的方便性，选择与HPLC色谱柱相同内径的RRHT色谱柱可以降低方法转换的可变性。本方法采用了与HPLC色谱柱相同内径（4.6mm）的RRHT色谱柱。如选用更小内径的色谱柱，可以在保持线速度相同的前提下获得相同的分离结果，并进一步降低溶剂消耗。
方法转换的初步参数确定
在Method Translator相应栏目中输入原始HPLC条件，包括HPLC色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数，并选择RRLC色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的RRLC分离的初步参数。
因小颗粒填料在较高的线速度下可以保持柱效（分离度），故可以通过提高流速的方式进一步提高分离速度。如需保持分离度相同，则在流速调整时要保持流速与梯度时间乘积不变，即提高流速的同时等比缩短梯度时间。本研究根据中国药典一部中给定的西洋参梯度分离条件和上述原则，确定了初始实验条件。
方法优化
起始试验条件虽然获得了与药典原始HPLC方法相似的RRLC分离谱图，但因色谱柱选择性的差异等影响，并没能基线分离结构相近的目标化合物Rg1与Re。因此，方法需要进行进一步摸索与优化。适当降低流动相在Rg1与Re出峰附近的洗脱强度，两色谱峰的分离度获得了初步改善，但仍未实现基线分离。考虑到温度对分离选择性的可能影响，尝试设置不同柱温考察分离选择性的变化。原始中国药典的方法所用柱温为40℃，本实验在原始条件的基础上，又分别在25℃和30℃下进行了分离（见图2）。
图2 不同温度下，Rg1与Re的分离度比较
从实验结果得知：降低温度有利于Rg1与Re的分离，25℃时Rg1和Re可以得到基线分离（分离度>2.0）（见图3），故最终选择25℃为柱温条件。最终优化获得的分离条件可以在11min内基线分离3个目标皂苷（分离度>2.0），加上洗脱保留较强杂质与平衡时间，一次运行总时间为20min，分离速度是原来HPLC分离速度（120min）的6倍，溶剂消耗也相应降低了。
图3 西洋参中人参皂苷的RRLC分离结果
RRLC色谱条件
系统：Agilent 1200快速高分离度液相色谱（RRLC），包括：在线脱气机（G1379B），SL型二元泵（G1312B），SL型自动进样器（G1367C），SL型柱恒温箱（G1316B）和SL型二极管阵列检测器（G1315C）。
检测池：2μl
峰宽：0.01min（0.2s）
狭缝：4nm
进样器后管线内径：0.12mm（Seat Capillary为0.17mm）
色谱柱：ZORBAX SB C18 RRHT色谱柱，4.6×50mm，1.8
流动相：A为0.1%的H3PO4，B为乙腈，梯度分离
柱温：25℃
流速：2ml/min
检测波长：203nm
进样量：5μl
RRLC分离的梯度重现性
使用RRLC系统进行快速分离不仅可以获得速度、分离度与灵敏度的改善，同时可以保持液相色谱分离技术的杰出重现性（见图4）。
图4 西洋参分析中RRLC梯度分离的重现性，色谱条件同图3
RRLC和HPLC的转换
RRLC的良好兼容型与灵活性，使用户可以根据需要在同一仪器硬件上灵活使用常规HPLC色谱柱和RRLC色谱柱。而键合相品牌丰富的ZORBAX RRHT色谱柱（如SB、XDB、Extend、Eclipse Plus等），又为相同品牌、不同粒径填料之间方法的相互转换提供了便利条件，使RRLC与HPLC之间方法的相互转换非常方便。基于现有RRLC分离条件，也可以非常容易地获得相应HPLC的分离方法。只需用Method Translator将参数进行直接转换，即可获得根据RRLC方法优化参数相应的HPLC条件参数。本研究使用相同的RRLC系统和HPLC色谱柱，获得了分离选择性与RRLC几乎完全相同的HPLC分离结果（见图5）。
图5 西洋参分析中HPLC与RRLC分离色谱图比较
值得注意的是：与RRLC相比，HPLC在相同进样量时获得的色谱峰高较低，故相对灵敏度较低。同时，分离时间也大大加长，溶剂消耗亦相应提高。
讨论与结论
－中国药典的药物分析方法中并未指定色谱柱品牌。而不同品牌、相同键合相的色谱柱又存在不同的选择性差异，故直接应用药典方法时往往需要对方法进行调整或优化，尤其是对于复杂样品的分离而言。使用小颗粒短柱的RRLC分离可以显著加快分离速度，故可以大大缩短方法开发和优化过程所需的时间。如此获得的RRLC分离条件，又可以简单方便地转换成常规HPLC方法，并在RRLC系统上实现HPLC分离。所以，使用RRLC系统进行分离会大大提高工作效率。
－RRLC分离不仅可以大幅度缩短分析时间，而且能够降低溶剂消耗。
－RRHT色谱柱拥有与常规HPLC内径相同的4.6mm色谱柱，使之可以接近或保持与HPLC相同的进样量。与HPLC相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的RRLC可以显著改善分离灵敏度。
－RRLC可以在快速分析中仍然保持出色的分离重现性。
－不同色谱柱具有不同的选择性，因而可以造成方法转换中的分离状况变化。选择具有相同键合相品牌的不同颗粒色谱柱，会简化HPLC与RRLC方法之间相互转换中的参数优化过程。ZORBAX系列RRHT色谱柱涵盖了非常丰富的键合相品牌，如SB、XDB、Eclipse Plus、Extend等，方便用户灵活选择与HPLC相同品牌键合相的小颗粒填料。
－温度对色谱柱选择性的调节作用不可小视。RRLC具有制冷功能的柱温箱，不仅温度控制范围宽（室温以下15～100℃），而且控温精确高（±0.05℃），即便在室温以下亦能精密控温。快速、精确的温度调节与控制能力，不仅保证了分离的保留时间重现性，而且为用户利用温度进行选择性调节提供了极大的便利。
色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB C18 4.6×150mm，5
流动相：A为0.1%H3PO4，B为乙腈，梯度分离
流速：1ml/min
其它条件同图2。(end)
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(1/9/2008) |
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